密码子优化是什么有什么作用？新手入门必看指南

密码子优化是什么

**密码子优化是根据目标生物体的密码子使用偏好，调整基因序列中密码子的组成，让基因在该生物体中更容易被“读懂”和表达的技术**，我们知道，DNA上的遗传信息通过密码子指导蛋白质合成，就像用字母拼单词，每个密码子对应一个氨基酸，但不同生物“拼单词”的习惯不一样，有的偏爱用这个密码子，有的偏爱那个，密码子优化就是把基因里的“单词”换成目标生物“常用”的,让基因表达更顺畅。

比如同样是编码精氨酸，大肠杆菌特别喜欢用CGU这个密码子，而人类细胞更爱用AGA，如果把人类的基因直接放到大肠杆菌里表达，大肠杆菌看到一堆AGA，就像我们看到一堆生僻字，读得慢还容易出错，蛋白表达量自然高不了，密码子优化就是把这些“生僻字”换成大肠杆菌认识的“常用字”，让它读得快、读得准。

密码子优化有什么作用

**密码子优化最直接的作用是提高蛋白表达量**，很多时候实验室辛辛苦苦克隆出基因，转进细胞里却几乎看不到蛋白，不是基因坏了，可能就是密码子不对路，我之前在实验室做大肠杆菌表达重组蛋白，一开始用的原始基因序列，培养了一周，蛋白浓度只有0.1mg/mL，跑电泳条带淡得像蚊子腿，后来导师建议做密码子优化，调整后再表达，三天就达到了1.2mg/mL，产量翻了十倍还多,当时激动得差点把离心管甩出去。

除了提高产量，密码子优化还能减少表达错误，有些稀有密码子会让核糖体在翻译时“卡壳”，导致蛋白合成中断或者出现错误折叠，优化后的密码子能让核糖体“一路绿灯”，合成出的蛋白不仅多，质量也更稳定，之前有个师姐做酶工程，原始基因表达的酶活性忽高忽低，优化密码子后，活性稳定了不说，半衰期还延长了两天,实验数据一下子就漂亮起来了。

密码子优化怎么操作步骤

**第一步是确定目标宿主**，不同生物比如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞，密码子偏好天差地别，选错宿主等于白忙活，我刚开始学的时候，把给酵母用的优化序列拿去转大肠杆菌，结果蛋白表达量比没优化还低，被导师笑了好久，选宿主要看实验目的，做基础研究用大肠杆菌或酵母就行，要是做药用蛋白，就得用哺乳动物细胞，比如CHO细胞,毕竟和人体更像。

第二步是获取原始基因序列，可以从GenBank数据库下载，也可以自己测序得到，序列一定要准确，要是有碱基突变，后面优化得再好也白费，我有次抄序列抄错了一个碱基，结果优化完表达出的蛋白完全没活性，回头检查半天才发现是原始序列抄错了,恨不得找个地缝钻进去。

第三步是选择优化工具，在线工具比如JCat、OptimumGene，本地软件比如DNAStar，各有各的用法，新手建议先用在线工具，不用安装，打开网页就能用，输入原始序列，选好目标宿主，工具就会自动分析序列里的密码子使用频率,然后把稀有密码子换成偏好密码子。

第四步是检查优化后序列，工具给出结果后，不能直接用，得自己检查有没有出现不该有的东西，比如提前终止密码子、复杂的二级结构，之前有个同学用工具优化完就送去合成了，结果序列里多了个终止密码子，蛋白合成到一半就停了，白花钱不说,还耽误了实验进度。

第五步是合成优化后基因并验证，把优化后的序列发给基因合成公司，合成好后转进宿主细胞，检测蛋白表达量，要是表达量没提升，就得回头看看是宿主选错了，还是优化时参数没设对,从头再来一遍。

密码子优化常用工具对比

OptimumGene是商业软件，功能强大到能考虑mRNA稳定性、翻译起始位点、密码子上下文等一堆因素，优化后的表达量通常很高，但它是收费的，而且价格不便宜，一般只有经费充足的实验室才会买,我们这种学生实验室基本用不起。

JCat是免费在线工具，由德国海德堡大学开发，操作简单到不行，打开网页，把基因序列粘贴进输入框，在宿主选项里选大肠杆菌、酵母还是人类细胞，点一下“Start Optimization”，等个一两分钟，优化后的序列、密码子使用频率表、GC含量分析就都出来了，我刚开始学密码子优化的时候，就是靠JCat练手，输入不同的序列，看它怎么优化,慢慢就明白哪些密码子是需要替换的。

GeneOptimizer是另一个商业工具，比OptimumGene稍微便宜点，优化算法更侧重翻译效率和mRNA结构，它的优势是能生成多个优化方案，让你选最适合自己实验的，但和JCat比，它的劣势很明显——要钱，而且必须注册账号才能用，不像JCat打开就能用,对新手不够友好。

DNAStar是本地软件，需要安装在电脑上，功能很全面，除了密码子优化，还能做序列比对、蛋白结构预测，它的好处是数据存在本地，不用担心序列泄露，适合处理一些保密的基因序列，但它对电脑配置有要求，老电脑跑起来会很卡，而且学习成本比在线工具高,新手要花好几天才能学会怎么用。

和这些工具比，JCat的优势在于完全免费，不需要注册，操作门槛低，输出结果详细，还会告诉你每个密码子为什么被替换，替换后的使用频率是多少，对新手来说简直是“保姆级”工具，虽然它的优化算法没有商业软件那么复杂，但对大部分基础实验来说完全够用了，性价比拉满，目前官方暂无明确的定价，因为JCat是学术机构开发的免费工具,一直对公众开放使用。

密码子优化案例分享

我师兄做的是大肠杆菌表达干扰素基因，原始基因是从人细胞里克隆来的，刚开始用原始序列转大肠杆菌，摇了三天菌，用Western blot检测，膜上只有淡淡的一条带，几乎看不到蛋白，导师让他试试密码子优化，他用JCat把序列优化了一下，替换了12个人细胞偏爱的密码子，换成大肠杆菌的偏好密码子，优化后的基因合成好，转进大肠杆菌，同样摇三天菌，这次Western blot的条带浓得发黑，蛋白浓度测出来有3.5mg/mL，比原始序列高了快20倍，师兄当时拿着结果单，手都在抖，那可是他磨了两个月的实验,终于看到希望了。

隔壁实验室有个师姐做酵母表达胰岛素前体，酵母表达真核蛋白本来就比大肠杆菌有优势，但她的原始序列表达量一直上不去，测了好几次，浓度都在0.1mg/L以下，后来她用密码子优化工具分析原始序列，发现里面有5个酵母的稀有密码子，还有一段GC含量高达75%的区域，容易形成复杂的二级结构，影响翻译，她把稀有密码子换成酵母偏好的，把GC含量高的区域调整到55%左右，优化后的序列转进酵母，培养一周后，胰岛素前体的表达量直接冲到了5mg/L，虽然离工业化生产还有距离,但对实验室研究来说已经完全够用了。

还有个同学做哺乳动物细胞表达单克隆抗体，抗体基因比较大，原始序列转进CHO细胞后，表达量忽高忽低，很不稳定，他用GeneOptimizer优化，选了“高翻译效率”和“mRNA稳定性”两个参数，生成了三个优化方案，试了第一个方案，表达量比原始序列高了3倍，但还是不稳定；试第二个方案，把密码子上下文也考虑进去了，表达量高了5倍，而且连续测了三次，波动都很小，终于解决了稳定性的问题，现在他的实验进展顺利得很,天天在实验室哼歌。

密码子优化常见问题解决

优化后表达量没提升是最让人头疼的问题，出现这种情况，先别急着怪工具，看看是不是目标宿主选错了，比如你明明要在酵母里表达，却选了大肠杆菌的密码子偏好，优化完当然没用，之前有个师妹就是这样，把酵母当成大肠杆菌来优化，结果表达量一点没涨，后来换了酵母的密码子偏好,一下子就上去了。

要是宿主选对了，那就看看是不是优化过度了，有些同学觉得稀有密码子越少越好，把所有密码子都换成偏好的，结果适得其反，其实细胞翻译的时候，偶尔遇到稀有密码子会“减速”，让新生肽链有时间正确折叠，全换成偏好密码子，翻译太快，肽链来不及折叠，就会形成包涵体，表达量看着高，其实都是没有活性的蛋白，这时候得把部分稀有密码子加回去，尤其是在蛋白折叠关键区域附近，留几个“减速带”,蛋白活性反而会提高。

优化后出现移码突变也挺常见的，这一般是因为优化时不小心改了碱基的数量，比如多删了一个碱基，或者多插了一个碱基，导致阅读框移位，解决办法就是优化完序列后，用翻译工具把DNA序列翻译成氨基酸序列，和原始序列比对一下，看看氨基酸序列有没有变，变了就是阅读框错了，得回头检查优化后的序列,把多删或多插的碱基改回来。

mRNA二级结构太复杂也是个麻烦事，优化后的序列如果GC含量太高，就容易形成发夹结构，核糖体根本结合不上去，翻译自然就没办法进行，这时候可以用RNAfold这样的工具预测一下mRNA二级结构，把结构复杂的区域找出来，调整里面的密码子，降低GC含量，让mRNA结构“舒展”一点,核糖体就能顺利结合了。

密码子优化新手学习资源

B站上有个UP主叫“生物萌新实验室”，他的密码子优化入门视频做得特别好，视频里用动画演示密码子是怎么指导蛋白质合成的，不同生物的密码子偏好有什么不一样，就像看动画片一样，比看教科书有意思多了，我当初就是看他的视频才搞明白，为什么大肠杆菌不爱用某些密码子，原来每种生物的tRNA丰度不一样，偏好的密码子就是tRNA多的那些,就像我们说话喜欢用自己熟悉的词一样。

NCBI的密码子使用数据库（Codon Usage Database）是个宝藏资源，里面收集了几千种生物的密码子使用频率数据，你想知道大肠杆菌的密码子偏好，就搜“Escherichia coli”，想知道酵母的，就搜“Saccharomyces cerevisiae”，数据详细到每个密码子的使用频率、相对同义密码子使用度（RSCU）都有，我每次做密码子优化前，都会先去这里查一下目标宿主的密码子使用情况，心里有个数,再用工具优化的时候就知道工具有没有瞎优化。

《分子克隆实验指南》这本书里有一章专门讲密码子优化，虽然有点老，但基础原理讲得特别清楚，书里还举了好几个不同宿主的优化案例，从原核到真核都有，看完之后对密码子优化的理解会更深一层，我们实验室的书架上就有一本，被翻得书皮都快掉了，谁遇到密码子优化的问题,都会去翻一翻。

在线课程的话，Coursera上有个“Gene Expression Analysis”课程，里面有一节讲翻译调控，提到了密码子优化在提高翻译效率中的作用，课程是英文的，但有中文字幕，听起来不费劲，老师会带着你分析真实的基因序列，怎么用工具优化，怎么验证优化效果，特别实用，我暑假的时候跟着学了一遍，感觉自己对密码子优化的理解一下子从“知道是什么”到“知道为什么这么做”了。