稀有密码子优化是什么怎么进行优化

稀有密码子优化是什么

要说稀有密码子优化,得先从密码子说起，密码子就像细胞里的“快递单号”，三个碱基一组，对应着要运送的“氨基酸包裹”，不同生物的细胞，对这些“快递单号”的偏好不一样，有的单号常用，有的单号一年也用不了几次，这些不常用的就是稀有密码子，我之前在实验室做蛋白表达时，就被这东西坑过——明明基因序列没错，转进细胞里就是不干活，蛋白表达量低得像撒哈拉沙漠里的雨滴，后来才知道，是我用的基因里藏了一堆宿主细胞的稀有密码子，人家不认，翻译到那儿就“罢工”了。稀有密码子优化就是把这些“不受欢迎”的密码子，换成宿主细胞喜欢的“常用单号”，让细胞翻译蛋白时顺顺利利，不卡顿、不偷懒。

稀有密码子优化有什么用

优化这东西到底有啥用？说直白点，就是让实验少走弯路，我师姐之前做一个酶的表达，没优化前，酶活低得测都测不出来，实验室经费像流水一样花出去，结果啥也没捞着，后来咬咬牙做了稀有密码子优化，两周后再测酶活，数值直接翻了十倍，毕业论文的数据一下就够了，这就是优化的第一个好处：提高蛋白表达量，让你养细胞、提蛋白不再是“竹篮打水一场空”。

不光量多,质量也会变好，稀有密码子多的时候，核糖体翻译到那儿容易“卡壳”，一卡壳就可能出错，合成的蛋白要么没活性，要么结构畸形，优化后，核糖体就像在高速公路上开跑车，一路畅通，合成的蛋白“颜值”高、功能强，我之前帮老师优化过一个抗体基因，没优化前电镜下蛋白形态乱七八糟，优化后个个“身姿挺拔”，后续实验顺得不像话。

还有个隐藏好处：节省时间和成本，没优化时，你可能得反复换宿主、调条件，一两个月过去啥进展没有，优化后，基因转进去就能表达，半个月出结果，耗材、试剂钱都能省下一大笔，我们实验室现在做外源基因表达，第一步必做稀有密码子优化，谁也不想再体验“做了三个月啥也不是”的绝望。

稀有密码子优化怎么做

具体咋操作？其实不难，分三步走就行，第一步是“找问题”：先把你的基因序列找出来，用在线工具分析一下，看看哪些是宿主的稀有密码子，我常用的是JCat，输入基因序列和宿主物种，点一下“分析”，它就会像扫描仪一样，把所有稀有密码子标出来，还会告诉你优化前后的“密码子适应指数”（CAI）——CAI越接近1，说明越受宿主欢迎。

第二步是“换密码子”：把标出来的稀有密码子，换成宿主偏好的同义密码子，这里有个小技巧，不是所有稀有密码子都得换，得看位置，如果稀有密码子堆在基因开头，或者在蛋白功能区附近，就得重点换；如果散在非关键区域，换不换影响不大，我上次优化一个膜蛋白基因，开头连续三个稀有密码子，直接导致翻译起始困难，换成偏好密码子后，表达量一下就上来了。

第三步是“验证效果”：优化完的基因得合成出来，转到宿主细胞里试试水，转进去后，别光看有没有蛋白，还得测活性、看结构，我之前优化过一个荧光蛋白基因，表达量是高了，但荧光很弱，后来发现是把一个关键位置的密码子换错了，导致蛋白折叠出问题，所以验证这步不能省，不然白忙活一场。

稀有密码子优化工具对比

市面上工具不少,各有各的脾气，先说JCat，这是我入门时用的“小白友好型”工具，界面像儿童画板一样简单，输入序列、选宿主，几分钟就出结果，连密码子替换建议都给你标好了，适合新手或者赶时间的时候用，但它有个缺点，不太考虑mRNA的二级结构，有时候优化完密码子，mRNA却折叠成一团，核糖体进不去，照样表达不出来。

再说说OptimumGene，这工具就像个“细节控”，不仅看密码子偏好，还会分析mRNA的二级结构、GC含量、重复序列这些，我上次优化一个长链基因，用JCat优化后CAI挺高，但表达量还是不行，换OptimumGene一分析，发现mRNA中间形成了个稳定的发夹结构，优化时把发夹拆开，表达量立马上去了，不过它参数设置有点复杂，像在玩“密室逃脱”，第一次用得花半小时研究怎么调参数。

GeneOptimizer则是“数据库王者”，收录了上千种生物的密码子偏好数据，连一些冷门的古细菌、真菌都有，我师兄做极端环境微生物的蛋白表达，别的工具找不到宿主数据，就靠它搞定了，但它是收费工具，免费版功能有限，像个“试用装”，想解锁全部功能得花钱，对穷学生不太友好。

新手、简单基因用JCat；复杂基因、追求细节用OptimumGene；冷门宿主找GeneOptimizer，选对工具，能少走一半弯路。

影响稀有密码子优化的因素

优化效果好不好,不是光换密码子就行，还得看几个“拦路虎”，第一个是宿主种类，不同生物的密码子偏好差得老远，就像南方人爱吃米饭，北方人爱吃面食，你给大肠杆菌优化用人类的密码子偏好，纯属“对牛弹琴”，我之前帮同学优化酵母表达的基因，误用了大肠杆菌的偏好表，结果蛋白表达量比没优化还低，被老师骂了一顿，所以第一步必须确认宿主是谁，选错了全白搭。

第二个是基因长度，短基因（比如几百bp）优化起来简单，稀有密码子少，换几个就行，长基因（比如几千bp）就麻烦了，稀有密码子可能扎堆出现，还得考虑mRNA的稳定性，优化起来像在“拆炸弹”，改一个地方可能影响另一个地方，我师姐优化一个5kb的基因，改了三遍才成功，头发都熬白了几根。

第三个是蛋白结构，有些蛋白的活性依赖特定的氨基酸序列，虽然密码子是同义替换，但可能影响翻译速度，进而影响蛋白折叠，比如有些酶的活性中心附近有稀有密码子，故意让翻译慢下来，给蛋白折叠留时间，你把它换成快密码子，反而会让蛋白“折错胳膊断错腿”，我之前优化一个蛋白酶基因，把活性中心附近的稀有密码子换了，结果酶活直接降为零，后来又换回去才恢复，白忙活一周。

稀有密码子优化案例分享

说个我自己的“踩坑又爬坑”案例吧，大三那年，我跟着导师做一个抗冻蛋白的研究，目的是看看这蛋白能不能用在冷冻食品里，减少冰晶损伤，刚开始，我们直接合成了从北极鱼里克隆的基因，转到大肠杆菌BL21里表达，诱导了三天，跑SDS-PAGE一看，目标条带弱得像没墨的笔写的字，考马斯亮蓝染色都快看不出来，我当时急得晚上睡不着，导师让我用JCat分析序列，结果发现这基因里大肠杆菌的稀有密码子占了23%，其中有一段连续6个AGG（精氨酸密码子，大肠杆菌极稀有），就像在翻译路上设了6个路障。

没办法,只能优化，我把那6个AGG全换成大肠杆菌偏好的CGU，其他稀有密码子也按偏好表替换，还特意避开了容易形成mRNA二级结构的序列，合成新基因后，转进同样的BL21里，诱导24小时再跑胶，那条带浓得像用马克笔描过一样，亮度是之前的5倍！提蛋白测活性，抗冻效果比文献报道的还好，后来这数据还帮导师发了篇核心期刊，现在想想，当时要是没做稀有密码子优化，估计我毕设都得延期。

还有个师兄的案例更绝,他做一个膜蛋白，疏水性强，本来就难表达，加上稀有密码子多，试了好几个宿主都不行，后来他用OptimumGene优化，不仅换了密码子，还调整了mRNA的GC含量，让mRNA更稳定，最后在酵母里成功表达，现在都在申请专利了，所以说，稀有密码子优化有时候真能“起死回生”。